摘要：目的了解川西獐牙菜SwertiamussotiiFranch甲羟戊酸途径中的关键酶甲羟戊酸激酶基因（MK）的功能，并进一步推进川西獐牙菜中的甲羟戊酸途径的研究。方法根据川西獐牙菜的转录组信息，获得了川西獐牙菜MK（SmMK）基因的全长cDNA序列，并且设计了特异性引物，利用RT-PCR对该基因进行了克隆；利用生物信息学方法，对SmMK基因的序列进行分析；构建原核表达载体MBP-SmMK，转入大肠杆菌Rosetta（DE3）中，然后对SmMK基因进行了原核表达，并对其进行了纯化。结果SmMK基因cDNA全长为bp，共编码个氨基酸。SmMK与其他植物中的MK具有较高相似性。对其信号肽、跨膜区域、蛋白定位及二级结构和三维构象进行了预测分析。SDS-PAGE检测表明所纯化蛋白与预期蛋白的大小相一致，为。结论为进一步研究川西獐牙菜中MK的功能奠定了基础，并为进一步研究川西獐牙菜中的甲羟戊酸途径，提高川西獐牙菜中类异戊二烯化合物的产量提供了依据。
川西獐牙菜SwertiamussotiiFranch是龙胆科（Gentianaceae）獐牙菜属SwertiaL.植物，生长在海拔～m的青海、西藏等高海拔较为寒冷的地区[1]。藏茵陈是“藏药八珍之一”，始载于《四部医典》，是藏药中极具特色的治疗热症、血液病和肝胆病的常用药物[2]。而川西獐牙菜则是作为藏茵陈的基原植物，全草入药，常被用于治疗黄疸型肝炎、肝硬化、肝腹水等疾病，并且现今已经生产片剂、针剂，疗效甚佳。其主要化学成分为萜类、环烯醚萜苷类、三萜类等，其中有效成分为獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷等均属于类异戊二烯化合物[3-5]。植物类异戊二烯化合物是一类具有多种药理、生理活性的天然产物，植物中合成类异戊二烯等化合物，主要是通过甲羟戊酸（mevalonate，MVA）途径与甲基藓醇磷酸（methylerythritolphosphate，MEP）途径进行合成[6]。
MVA途径主要存在于细胞质中，故而又称为细胞质途径。该途径以乙酰辅酶A为原料，经过一系列的酶促反应生成异戊烯基焦磷酸（IPP）[6]。而人们熟知的许多重要的有效成分，例如，植物甾醇、胡萝卜素、青蒿素、丹参酮及紫杉醇等，均是植物中异戊二烯焦磷酸的下游产物[7]。甲羟戊酸激酶（MK）则是在该途径中的限速酶之一，是催化甲羟戊酸转变为5-磷酸甲羟戊酸的关键酶，负责将腺嘌呤核苷三磷酸（ATPγ）位的磷酸基团转移到甲羟戊酸第5位羟基，同时伴随着二磷酸腺苷（ADP）的释放[8]。目前，不仅从拟南芥[9]、小麦[10]、茶树[11]中分离鉴定出了MK，而且三七[9]、独行菜[12]、滇龙胆[13]、杜仲[14]等许多药用植物中亦分离出了MK基因。
本研究根据前期实验中得到的川西獐牙菜转录组数据，分析得到了川西獐牙菜MK（SmMK），并且通过设计特异性引物，利用RT-PCR扩增得到了其cDNA序列，并进行了克隆和测序。后利用生物信息学方法，将其与其他植物中的MK进行了同源性比较分析，以及对其二级结构、三维构象、跨膜结构及信号肽等信息进行了较为详尽的预测分析。构建原核表达载体MBP-SmMK，转入大肠杆菌Rosetta（DE3）中进行原核表达，并对该蛋白进行了纯化。为进一步研究SmMK的功能奠定了基础，同时为进一步研究川西獐牙菜中的MVA途径，从而提高川西獐牙菜中类异戊二烯化合物的产量提供了依据。
1材料和试剂
1.1材料
野生川西獐牙菜SwertiamussotiiFranch的种子，收采于中国青海省玉树县，由青海大学董汇泽教授进行分析鉴定。实验中所用到的材料为在实验室中光照16h，黑暗8h，22℃培养种植的川西獐牙菜植株。
1.2试剂
pETMALc-H原核表达载体由北京中国科学院植物所惠赠。大肠杆菌EscherichiacoliTrans5α、Rosetta（DE3）菌种、TransStartFastPfuFlyDNAPolymerase和pEASY-BluntSimpleCloningKit购于全式金生物有限公司；EastepSuper总RNA提取试剂盒购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；ReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）试剂盒、即用型蛋白质分析量标准（高）、BamHI限制性内切酶、SalI限制性内切酶、10×TBuffer、T4连接酶、DLDNAmarker、DL1DNAmarker和dNTP均购自大连宝生物公司（TAKARA）；异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside，IPTG）、卡那霉素、EDTA、Tris-HCl均购自北京鼎国昌盛生物科技有限公司；AmyloseResin购买于NEB公司；快速琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒购买于北京康为世纪有限公司；引物合成和基因测序由华大基因有限公司完成。
2方法
2.1川西獐牙菜叶片总RNA提取及cDNA合成
剪取新鲜已抽薹的川西獐牙菜叶片0.04g，放置于1.5mL的EP管中，液氮速冻，用手持式研磨器迅速研磨成粉状，按照EastepSuper总RNA提取试剂盒的说明书进行叶片总RNA的提取，用1%的琼脂糖凝胶和Nanodrop进行RNA的质量检测。根据ReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）试剂盒提供的说明书对叶片总RNA进行反转录合成cDNA。
2.2SmMK基因的克隆
根据川西獐牙菜的转录组信息获得的SmMK基因全长序列并且结合原核表达载体pETMALc-H的多克隆酶切位点设计特异性引物，SmMK-up：5’-CGGGATCCATGGAGGTAAGAGCCAGAGC-3’；SmMK-dp：5’-ACGCGTCGACTTAGGAAGATCC-GCTGAAGG-3’（下划线部分为酶切位点序列）。以cDNA为模板进行PCR扩增，50μL的PCR体系：SmMK-up（10μmol/L）1μL；SmMK-dp（10μmol/L）1μL；dNTP（2.5μmol/L）4μL；5×TransStartFastPfuFlyBuffer10μL；双蒸馏水31μL；TransStartFastPfuFlyDNAPolymerase（U/μL）2μL；川西獐牙菜叶片cDNA1μL。阴性对照为将该体系中的模板替换为1μL双蒸馏水。反应条件为94℃、5min；94℃、30s；60℃、30s；72℃、80s；31个循环；72℃延伸10min。获得的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，用快速琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收。根据pEASY-BluntSimpleCloningKit的说明书，将回收产物与pEASY-BluntSimplevector进行连接，转化进入EscherichiacoliTrans5α，涂布于带有卡那霉素抗性的LB培养基上，37℃，12h培养，利用PCR挑选阳性克隆后，送去华大基因公司进行测序。
2.3SmMK基因的生物信息学分析
利用NCBI网站中的BLAST程序，进行序列比对，分析SmMK与其他植物的MK基因的同源性；使用DNAMAN软件对氨基酸序列进行比对；MEGA7.0构建neighbor-joining系统进化树，bootstrap重复次数为次。用ExPASyProteomicsServer网站提供的在线工具Protparam（
本文编辑：佚名
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