[摘要]：该文研究36种常用中药材80%乙醇提取物在体外抗临床常见致病菌的抗菌活性。采用药敏纸片法测耐药菌的耐药谱，中药粗粉用80%乙醇浸泡提取，提取液减压浓缩得浸膏，通过琼脂打孔法测定提取物抑菌圈，再通过微量倍比稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。结果表明：36种中药材醇提物中，有15种具有广谱抗菌活性，对实验中各标准菌表现出不同程度的抑制作用，对MRSA抗菌活性也较强。其中，岩陀、卷柏、首乌藤、苏木、乌药、夏枯草6种药材的抗菌活性比较突出，抑菌圈均大于11mm，细菌对其表现为中高度敏感；它们对7株标准菌的MIC/MBC值除个别为12.5mg·mL-1以外，均小于1.mg·mL-1，对16株MRSA的MIC/MBC值均小于1.mg·mL-1，它们的萃取层活性均小于1mg·mL-1。所筛选出的15种抗菌活性较强的中药材，可为后续研究其活性单体化合物和作用机制，研发有效的抗多重耐药菌的中药制剂以及解决细菌耐药性问题提供一定的参考。[关键词]：中药材；金黄色葡萄球菌；大肠埃希菌；白色念珠菌；铜绿假单胞菌；抗菌活性；最低抑菌浓度；最低杀菌浓度金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)、大肠埃希菌(Escherichiacoli，EC)、白色念珠菌(Candidaalbicans，CA)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)医院和社区感染常见的致病菌。SA医院内首要的致病菌，尤其是出现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)等多重耐药菌。MRSA具有较高的感染率和致死率，成为所谓的“超级细菌”，被列为世界范围内最难解决的感染菌之一(Patel，；Fosteretal，)。EC在自然环境中广泛存在，是哺乳动物小肠内的共生菌，但其又是条件致病菌，致病性的EC能引起人类及动物的感染(Blancoetal，)；能通过多种感染渠道导致EC感染疫情大规模爆发，其耐药性的出现引起了广泛担忧(卫昱君等，)。CA是一种寄生在正常人口腔、呼吸道、消化道及生殖道等部位的机会性致病真菌，常可能引起浅表或深部的感染，严重者可引起系统性感染甚至危及生命(Gowetal，)。PA的感染仅次于大肠埃希菌、克雷伯菌等常见病原菌，可通过环境污染、交叉感染、内源性感染和医源性感染等途径传播(吴明权等，)；临床上常见于尿路感染、呼吸道感染和免疫力低下的病人痰液、尿液中，甚至会引起严重的囊性纤维化病(Pier，)。由于全球范围内抗生素的不合理应用，细菌耐药性对人类的危害越来越严重，且有不可抑制的趋势。在化学药抗生素相对匮乏的今天，人们把更多的目光投向了来源广泛、安全性高、毒副作用小、价格低廉、抗耐药机制独特的中草药，积极研发新型的“中药绿色抗生素”，希望能从中找到解决耐药性问题的新思路、新途径。所以近年来筛选、提取、分离天然植物及中草药中有效的耐药抑制剂或抗菌活性成分，探讨其抗耐药性机制，已成为药学领域研究的热点(韩飞等，)。本研究通过研究36种中草药对上述四种标准菌以及MRSA耐药菌的体外抑制作用，以筛选出抑菌活性较好的中草药，为后续研究其活性单体化合物，开发有效的抗多重耐药菌的中药制剂缓解细菌耐药性问题，提供一定的参考。1材料与方法1.1材料和菌株1.1.1材料受试中药材种名及序号见表1。1-12购买于云南省昆明市螺蛳湾中药材市场，13-36医院中药房提供。培养基：M-H琼脂培养基(Mueller-HintonAgar，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号为0217)，M-H肉汤培养基(MHBroth，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号为)，用于细菌体外抑菌实验；液体沙氏培养基(LiquidSabourandMedium，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号为0822)，沙氏琼脂培养基(Sabouraud’sAgar，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，批号为0811)，用于真菌体外抑菌实验。试剂：NaCl(四川西陇化工有限公司，批号为)，二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO，利安隆博华(天津)医药化学有限公司，批号为)，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均为工业级(重新蒸馏后使用)，均购自昆明福海达化玻仪器有限公司。1.1.2菌株标准菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC、ATCC、ATCC)、大肠埃希菌(ATCC)、铜绿假单胞菌(ATCC)、白色念珠菌(ATCCY、ATCCSC)，均由中国药品生物制品检定所提供。耐药菌株：MRSA、MRSA、MRSA、MRSA23、MRSA42、MRSA、MRSA、MRSA、MRSA、MRSA8、MRSA98、MRSA15、MRSA、MRSA、MRSA40、MRSA22均医院微生物实验室临床分离得到。药敏纸片购自温州市康泰生物科技有限公司。1.2方法1.2.1药物提取物的制备将36种中药材粉碎并过50目筛，各称取30g。用80%的乙醇室温下共浸泡6次：第1次浸泡7d；第2、第3次浸泡5d；第4、第5次浸泡3d；第6次浸泡1d。每次浸泡液经6层纱布过滤，合并滤液，用减压旋转蒸发仪浓缩(温度控制在40℃以下)得到浸膏，用结晶刀转移至无菌玻璃瓶中，4℃下封口保存备用。其中，部分药物浸膏依据所测抗菌活性选择活性较好的用蒸馏水分散，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚层、乙酸乙酯层、正丁醇层和水层四个萃取层，减压回收得到各个萃取层的浸膏备用。1.2.2耐药菌株耐药谱的测定耐药菌株的药敏测定以常规方法培养，耐药性按抗菌剂药敏常用测试方法K-B纸片扩散法(Kirby-Bauerdiffusionmethod)进行(各操作均于超净工作台中进行，下同)，以ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute(CLSI)版(CLSI：M02-A11，)推荐方法为判断依据。1.2.3药液的制备用电子分析天平精确称取乙醇提取物各mg于4mL离心管中，先加入含10%DMSO于漩涡混合器上助溶(或超声助溶)，然后再加入生理盐水配成浓度为50mg·mL-1的药液用于测定抑菌圈、MIC，10%DMSO作为空白对照。萃取层则是各称取32mg于2mL离心管中，先加入含10%DMSO于漩涡混合器上助溶，再加入生理盐水配成浓度为16mg·mL-1的药液用于测定MIC，10%DMSO作为空白对照。1.2.4菌悬液的制备将细菌菌株接种于琼脂平板上，细菌接种于M-H琼脂培养基上，真菌接种于沙氏琼脂培养基上，置于(35±2)℃恒温箱中培养24h。采用0.5号麦氏比浊管仔细对比调整细菌浓度为1.5×CFU·mL-1，真菌用细胞计数板在显微镜下观察调整浓度为1.0×CFU·mL-1，此浓度菌悬液用于琼脂打孔法测定提取物的抑菌圈；取一定量上述菌悬液，用生理盐水稀释，细菌稀释倍为0.5×CFU·mL-1，真菌稀释倍为1.0×CFU·mL-1，用于MIC的测定。1.2.5琼脂打孔法测定提取物的抑菌圈首先，将已灭菌的琼脂培养基(细菌用M-H琼脂培养基，真菌用沙氏琼脂培养基)倒入灭过菌的培养皿上(厚度约3mm)。然后，在培养基上用直径6mm的无菌打孔器打孔，用无菌棉签蘸取浓度为1.5×CFU·mL-1的标准细菌菌液均匀涂布于M-H琼脂培养基上，浓度为1.0×CFU·mL-1的标准真菌菌液均匀涂布在沙氏琼脂培养基上，每孔加入50mg·mL-1的药液50μL，不得溢出。最后，将培养皿置于(35±2)℃恒温箱中培养24h后取出观察结果，用卡尺测量抑菌圈的直径并记录，平行实验3次，取平均值。1.2.6最低抑菌浓度(MIC)的测定微量倍比稀释法测定MIC，均按照CLSI版指南进行(CLSI：M07-A9，)。采用微量倍比稀释法测定各个样品对不同菌株的活性即MIC值(赵婷等，；吴盘红等，)(细菌用M-H肉汤培养液，真菌用液体沙氏培养基)。首先取无菌96孔平底微量培养板，用8通道移液枪加入培养液μL；然后在第1行每孔依次加入受试药物μL，混匀后取出μL移至第2行中，以此类推，进行倍比稀释直至第8行混匀后弃掉μL，使稀释后各孔中的受试药物浓度倍比降低；最后加入细菌或真菌的稀释菌悬液μL。设含10%DMSO相应培养液μL加相应菌悬液μL作阳性空白对照，相应液体培养液μL作阴性空白对照。将培养板置于(35±2)℃恒温箱中培养24h后取出观察结果，测定其MIC值。在显微镜下涂片观察，视野中细菌或真菌个数小于5个时作为此药物对此种菌的MIC对应孔，记录此孔药物浓度即为MIC值。平行实验3次，取平均值。1.2.7最低杀菌浓度(MBC)的测定确定MIC后，用接种环分别蘸取MIC值对应孔前3~5孔的培养液，转接种于相应琼脂平板上(细菌用M-H琼脂培养基，真菌用沙氏琼脂培养基)，置于(35±2)℃恒温箱培养24h后取出观察结果。用活菌计数法检查琼脂平板上的菌落，平均数小于5个的最小药物浓度即为此药物对此种菌的MBC。平行实验3次，取平均值。2结果与分析2.1耐药谱测试结果通过对16株临床分离的MRSA的药敏测试，从表2可以看出，16株菌除对万古霉素均敏感外，对其他各类抗生素均有不同程度的耐药，且大多表现为多重耐药。2.2抑菌圈的测定结果通过琼脂打孔法测定各药材的抑菌圈，如表3所示。根据药理学方法判定：抑菌圈直径d10mm为细菌对药物表现为耐药；d=10mm为轻度敏感；11≤d≤15mm为中度敏感；d≥16mm为高度敏感。36种中药材的醇提物对各标准菌表现出不同程度的抑制作用，对于SA，苏木和乌药的抑菌圈d均大于16mm表现为高度敏感具有强抑制作用，岩陀、首乌藤、卷柏、夏枯草、香叶、金钱草抑菌圈11≤d≤21.5mm为中高度敏感具有较强抑制作用，白及、侧柏叶、木瓜、干姜为轻中度敏感；对于EC，苏木、乌药、岩陀、首乌藤、夏枯草、香叶、金钱草、侧柏叶、五味子、秦皮、沉香(二级)的抑菌圈d均大于16mm为高度敏感具有强抑制作用，卷柏、白及、木瓜、干姜、山茱萸、藁本、柴胡、竹茹、茜草、胡黄连、川续断抑菌圈11≤d≤15mm为中度敏感具有较强抑制作用；对于PA，首乌藤抑菌圈d=16mm为高度敏感，苏木、乌药、岩陀、山茱萸抑菌圈11≤d≤15mm表现为中度敏感具较强抑制作用，其余药材抑菌效果均不明显；36种中药材对CA的抑制效果均不明显。10%DMSO抑菌圈不明显，表明10%DMSO对该菌没有抑菌活性或抑菌活性不强，不影响实验结果。2.3MIC和MBC测定结果通过微量倍比稀释法分别测定了药物提取物和提取物萃取层对各标准菌或MRSA耐药菌的抗菌活性。所测各组实验中，阳性对照显示细菌长势良好，排除10%DMSO对实验的干扰；阴性对照显示无细菌生长，表明该实验操作规范、无污染、数据有效。表4结果表明，苏木、卷柏、夏枯草、岩陀、乌药、侧柏叶、金钱草、香叶、秦皮、五味子、山茱萸、茜草、沉香(二级)、狼毒大戟、南沙参15种药材对四种标准菌都有不同程度的抑制作用，具有广谱的抗菌活性。其中，苏木、卷柏、夏枯草、岩陀、首乌藤、乌药6种中药提取物对SA和EC的MIC/MBC值均在0.~0.mg·mL-1之间，说明抗菌活性很好。根据表4结果，选取抑菌活性较好的9种药材提取物萃取后，各萃取层对标准菌的MIC/MBC测定结果如表5所示，各药乙酸乙酯层的抑菌活性均比其他萃取层的显著，说明这些药材的有效抗菌活性成分主要集中在乙酸乙酯层萃取物中，为后续天然化合物的分离提供了活性追踪分离导向。同时，选取其中24种抗菌活性较好的中药材，对16株MRSA耐药菌进行体外抗菌活性测定。表6结果显示，除鸡蛋花、狼毒大戟、胡黄连外，其他21种中药提取物对MRSA都有不同程度的抗菌活性，抑菌作用良好；其中岩陀、苏木、乌药、侧柏叶、卷柏、夏枯草、沉香(二级)、首乌藤、白及、香叶、五味子、沉香(特级)12种中药材抗菌活性较为显著。3讨论与结论
随着细菌耐药性问题的日趋严峻，中药作为潜在的新型绿色的细菌耐药抑制剂愈来愈受到人们的
本文编辑：佚名
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